Instytut Podstawowych Problemów Techniki

UMO-2019/34/H/NZ6/00699

2020-09-01 / 2024-04-30

Koordynator

Fundusze Norweskie / EOG

GRIEG

Głównym celem projektu jest analiza interakcji komórek “Naturalnych Zabójców” (NK) z zakażonymi wirusem komórkami nabłonka płuc na poziomie pojedynczych komórek. Będziemy badać dwie linie komórek nabłonka, z których jedna ma pochodzenie nowotworowe oraz dwa wirusy: syncytialny wirus nabłonka oddechowego (RSV) oraz wirus grypy typu A (IAV). Nasze główne zadania badawcze są następujące: • wyjaśnienie wpływu cytotoksyczności komórek NK wobec zakażonych komórek na dynamikę rozprzestrzeniania się oraz eliminacji infekcji wirusami RSV i IAV, a także różnic w aktywności komórek NK wobec zakażonych i niezakażonych subpopulacji obserwowanych w hodowli komórek oddechowych. • ustalenie potencjału komórek NK do indukowania w zakażonych komórkach tzw. immunogennej śmierci komórkowej zdolnej do aktywacji mechanizmów nabytej obrony odpornościowej; • rozwój systemu mikrofluidyki kropelkowej przeznaczonej do prowadzenia doświadczeń na kokulturach komórek nabłonkowych i komórek NK, który pozwoli na zbieranie danych na poziomie poszczególnych komórek; • rozwój agentowego modelu matematycznego opisującego interakcje komórek NK z zainfekowaną populacją komórek nabłonkowych na poziomie pojedynczych komórek. Metodologia: Mamy zamiar połączyć techniki doświadczalne oparte o mikrofluidykę z metodami obrazowania pojedynczych komórek i modelowaniem matematycznym. Będziemy analizować interakcje komórek NK z zainfekowaną wirusem populacją komórek, skupiając się na fizjologicznie istotnych sytuacjach, w których wyjściowo zakażona jest tylko niewielka frakcja komórek. Zgodnie z obserwacjami poczynionymi w ramach naszych obecnych badań, w takim przypadku odpowiedź populacji komórek jest wysoce heterogenna, a obserwowana niejednorodność ma istotne znaczenie dla rozwoju wrodzonej odpowiedzi odpornościowej. Analiza takiej populacji stwarza jednakże problemy, które mamy zamiar przezwyciężyć poprzez połączenie następujących technik: a) obrazowanie mikroskopowe żywych komórek przy użyciu markerów fluorescencyjnych, umożliwiających obserwację zmian poziomu białek wirusowych, aktywacji głównych białek komórkowych oraz indukcji śmierci komórkowej; b) obrazowanie mikroskopowe utrwalonych komórek, które umożliwią obserwację większej liczby komponentów układu odpornościowego w określonych punktach czasowych. Oprócz barwienia zestawów białek przy użyciu metod immunofluorescencji, planujemy zastosować również RNA FISH c) analizę białek oraz ekspresji genów i produkcji cytokin zaangażowanych w odpowiedź antywirusową przy pomocy RT-PCR, digital PCR, Western blot, ELISA i innych odpowiednich technik d) system mikrofluidyki kropelkowej do hodowli komórek nabłonkowych i NK w kokulturze przy jednoczesnym zastosowaniu technik pomiarowych z punktów a) i b); e) modelowanie matematyczne wykorzystujące procesy Markowa do opisania replikacji wirusów, wewnątrz- i międzykomórkowego przekaźnictwa sygnału, aktywacji komórek NK i efektów cytotoksycznych w heterogennych populacjach komórek. Uwzględnione zostaną efekty przestrzenne dyfuzji cytokin i rozprzestrzeniania się wirusa.