Instytut Podstawowych Problemów Techniki

UMO-2019/35/B/NZ2/03898

2020-07-27 / 2024-07-26

Jedyny wykonawca

NCN

OPUS

18

Szlaki sygnalizacyjne przetwarzają i przekazują sygnały receptorów błonowych do efektorowych kinaz, takich jak ERK i AKT, które regulują komórkowe procesy fizjologiczne. Postulujemy, że pulsacyjna stymulacja cytokinami (1) jest fizjologicznie najbardziej rozpowszechniona z powodu lokalnej sekrecji cytokin oraz ich endocytozy wraz z związanych z nimi receptorami oraz (2) umożliwia najszybszy przekaz informacji (w tempie kilku bitów na godzinę). Postulujemy również, że mutacje onkogenne zmniejszają zdolność szlaków ERK i AKT do poprawnego przekazu sygnałów, co prowadzi do niewłaściwej regulacji proliferacji, apoptozy i ruchliwości. W projekcie tym skupimy się na stymulacji pulsacyjnej i użyjemy teorii informacji do analizy wpływu mutacji onkogennych na przekaz sygnału. CELE: Głównym celem projektu jest ustalenie wpływu onkogennych mutacji KRAS-G12V oraz PI3K-H1047R na tempo przekazu informacji i regulację proliferacji, apoptozy i ruchliwości. Nasze główne cele są następujące 1) Wyznaczenie górnej granicy tempa przekazu informacji w komórkach niezmutowanych oraz zawierających mutacje KRAS i PI3K. Mamy zamiar zweryfikować hipotezę, że mutacje zmniejszają tempo przekazu informacji poprzez wywoływanie spontanicznej aktywacji ERK i rozszerzenie profilu aktywności ERK w czasie. 2) Analiza mechanizmu spontanicznej aktywacji ERK i AKT w komórkach z mutacjami onkogennymi. Zbadamy czy w obrębie nanowarstwy komórek, spontaniczna aktywacja ERK i AKT jest przestrzennie skorelowana, tj. czy sąsiednie komórki są jednocześnie aktywowane. 3) Analiza lokalnej aktywacji RAS i przekazu sygnału przez szlak RAF/MEK/ERK w odpowiedzi na świetlną aktywację opto-FGFR na małym obszarze błony komórkowej. Przypuszczamy, że lokalna aktywacja RAS wykazuje dwustabilność, ale gdy uśredni się ją po całej powierzchni błony, jest proporcjonalna do siły sygnału. W rezultacie aktywacja AKT też jest stopniowa, proporcjonalna do części błony z aktywnym RAS, podczas gdy aktywacja ERK jest skokowa z powodu ultra-wrażliwości spowodowanej podwójną fosforylacją kinaz MEK i ERK. 4) Stworzenie modelu matematycznego szlaków ERK/AKT uwzględniającego efekty przestrzenne aktywacji RAS. 5) Stworzenie agentowego modelu propagacji aktywności ERK w nabłonku wywołanej apoptozą jednej komórki lub zranieniem. Agentami byłyby komórki wykonujące program ERK/AKT. METODY: Użyjemy komórek MCF10A typu dzikiego oraz z mutacjami KRAS i PI3K, zawierających świetlenie aktywowany FGFR oraz markery aktywności AKT i ERK. Linie te, niedawno wyprowadzone przez partnera projektu, prof. Olivera Pertz’a, umożliwią nam precyzyjne stymulowanie komórek wybranymi protokołami pulsacyjnymi, oraz obserwacje przy użyciu przeżyciowej mikroskopii konfokalnej profili czasowych aktywacji ERK i AKT. Użyjemy reporterów aktywności RAS i PI3K, wprowadzonych do komórek metodą transfekcji, do zaobserwowania lokalnej aktywności tych kinaz przy użyciu przeżyciowej mikroskopii TIRF. Do konstrukcji i analizy modeli matematycznych użyjemy równań różniczkowych zwyczajnych i cząstkowych oraz stochastycznego modelowania agentowego. Posłużymy się teorią informacji do wyznaczenia tempa przekazu sygnałów w oparciu o uzyskane dane eksperymentalne. ZNACZENIE: Po raz pierwszy użyjemy danych pochodzących z obserwacji pojedynczych komórek do oszacowania tempa przekazu informacji w kaskadach sygnalizacyjnych. Ustalimy czy i w jakim zakresie tempo to jest zmniejszone przez mutacje onkogenne w szlaku ERK (RAS-G12V) oraz w szlaku AKT (PI3K-H1047R). Spodziewamy się, że mutacje, oprócz zwiększenia ogólnej aktywności ERK i AKT, będą obniżać precyzje sterowania komórek przez sygnały zewnętrzne. Jest to istotne w kontekście terapii, ukierunkowanych wyłącznie na obniżenie aktywności szlaków ERK i AKT.